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稳定细胞株构建

发布时间: 2021-03-01  点击次数: 621次

稳转细胞系(稳定表达细胞株)指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上,使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后,通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细胞中经细胞克隆挑选得到的,由一个细胞扩增得到的细胞株。单克隆细胞株性状统一,传代过程中细胞的基因表达保持稳定。

       用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞,根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上,得到单细胞长出的阳性单克隆,继而得到稳定转染细胞株。常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。

       筛选稳定细胞株的两种方法
       1、转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系
       对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达,如果转染效率达到40%,基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验,对转染效率要求远远高于基因过表达,通常质粒转染无法满足。
       另外,质粒游离于细胞质中,很快降解,无法满足较长时间的检测项目;质粒转染整合几率极低,稳定细胞株构建耗时耗力,且得率很低,往往需要挑取单克隆株。
       2、病毒感染筛选稳定细胞株
       病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株,由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广,感染效率高,且与细胞染色体整合而不发生基因重排,是制备稳定细胞株的理想载体。
       稳定转染细胞株服务流程
      1、载体构建:将外源基因构建到合适的载体上,如需病毒转染,则包装病毒。
      2、筛选浓度测定:以 10-14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。
      3、细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到 60%-80% 覆盖。
      4、细胞转染:用构建好的载体(或包装好的病毒)转染目的细胞。
      5、抗生素筛选。
      6、鉴定筛选结果。
     终交付
     1、病毒滴度检测报告;稳转细胞株;
     2、结题报告,包括详细的实验流程,测序结果和峰图、引物序列、载体图谱和滴度测定报告和q-P

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