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P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶

简要描述:P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶是基于 Pyrococcus furiosus 的高温 DNA 聚合酶,具有耐热型 5´-3´ 的聚合酶活力以及 3´-5´的核酸外切酶活力,因此属于高保真 DNA 聚合酶

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所属分类:酶

更新日期:2020-09-03

厂商性质:经销商

详情介绍
品牌自营品牌规格100 U/500 U/1,000 U
供货周期现货主要用途PCR反应
应用领域生物产业

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶产品简介

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶是基于 Pyrococcus furiosus 的高温 DNA 聚合酶,具有耐热型 5´-3´ 的聚合酶活力以及 3´-5´的核酸外切酶活力,因此属于高保真 DNA 聚合酶(其保真度达到普通 Taq 酶的 55 倍)。该酶经过生物工程改造后,其扩增能力、保真度都得到提升,并且具有广泛的模板适应性,扩增速度达到 2-4kb/min。优化的 2×P6 buffer反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段 PCR扩增都具有良好的适应性,其中,质粒、λ DNA 等简单模板有效扩增长度可达 40 kb,cDNA 有效扩增长度可达 15 kb,基因组有效扩增长度可达 20 kb。

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶产品组成

组分 

P6 High-Fidelity DNA Polymerase 

2× P6 buffer 

dNTPs (10 mM each) 

Loading buffer 

产品应置于-20 ℃保存。

 

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶产品质控

1)性能检测 1

在 50 μL PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒,扩增 15 kb 的 DNA 目的片段,在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 15 kb 处检测到非常亮且单一的目的条带。

2)性能检测 2

在 50 μL PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、大肠杆菌菌落,扩增 5 kb 的 DNA 目的片段,在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 5 kb 处检测到较亮的单一目的条带。

3)大肠杆菌核酸残留检测:

在 20 μL 荧光定量 PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase 和大肠杆菌特异基因扩增引物(如 gapA);在不加入大肠杆菌 DNA 模板的情况下,20 个循环内荧光信号值在基线范围。

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶常规 PCR 反应体系: 6 High-Fidelity DNolymerase

2. PCR 反应参数(供参考):

(起始变性): 95 ℃ 5 min

(解链): 95 ℃ 30 sec

(退火): 55 ℃ 30 sec

(延伸): 72 ℃ x min (30-35 循环:2 kb/min)

(终延伸): 72 ℃ 7 min

1. 在冰浴上设置 PCR 反应(供参考):

模板: < 500 ng

2× P6 Buffer: 25 μL

Primer 1/2: 0.2 - 1.0 μM

dNTPs (10 mM): 1 μL

P6: 1 μL

灭菌蒸馏水 Up to 50 μL

 

P6 High-Fidelity polymerase 高保真酶应用实例

P6 扩增速度测试

以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA的片段,PCR反应程序设置为:95℃ 5min;98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec;72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下:

常规 PCR 扩增指南:

1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。

2. 大多数模板的预变性温度为 95 度,30 sec-5 min。

高 GC 含量模板预变性温度为 98 度,30 sec-5 min。

3. 常规退火时间设置为 10 sec,复杂模板设置为 10 sec-30 sec。

P6 扩增不同长度的 DNA 的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA 的片段,PCR 反应程序设置为:95 ℃ 5min;98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min;72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下:

长片段扩增指南:

1. 使用高质量的模板。

2. 增加引物长度提高退火温度,退火/延伸合并成一步。

3. 添加适当浓度的 DMSO,一般不高于 5%。

4. 增加体系中 P6 使用量。

5. 提高变性温度为 98 度,缩短变性时间为 5 sec。

P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA 的片段。

以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA的片段,程序设置为:95 ℃ 5min;95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec;72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下:

高 GC 和低 GC 模板扩增指南

1. 使用高质量的模板。

2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO,一般终浓度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度,还可使用 Touch down 的方法进行 PCR 扩增。

4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。



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