简要描述:P6 High-Fidelity polymerase高保真酶是将 PCR 反应用到的超保真 P6 DNA 聚合酶、buffer、dNTP Mixture 以及稳定剂以 2倍的终浓度进行混合。
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所属分类:酶
更新日期:2020-10-10
厂商性质:经销商
品牌 | 自营品牌 | 规格 | 1 mL/10 *1 mL/50 *1 mL |
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供货周期 | 现货 | 主要用途 | PCR反应 |
应用领域 | 生物产业 |
P6 High-Fidelity polymerase高保真酶
P6 High-Fidelity 高保真酶 DNA.Polymerase 是基于 Pyrococcus furiosus 的高温 DNA 聚合酶,具有耐热型 5´
-3´ 的聚合酶活
力以及 3´
-5´的核酸外切酶活力,因此属于高保真 DNA 聚合酶(其保真度达到普通 Taq 酶的 55 倍)。该酶经过
生物工程改造后,其扩增能力、保真度都得到极.大提升,并且具有广泛的模板适应性,扩增速度达到 2-4
kb/min。优化的 2×P6 buffer反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段 PCR扩增都具有良好的适应性,
其中,质粒、λ DNA 等简单模板有效扩增长度可达 40 kb,cDNA 有效扩增长度可达 15 kb,基因组有效扩增长
度可达 20 kb。
产品组成
组分
21804-1
21804-2
21804-3
P6 High-Fidelity polymerase高保真酶
100 U
5 × 21804-1
10 × 21804-1
2× P6 buffer
2 × 1.25 mL
dNTPs (10 mM each)
100 μL
Loading buffer
1 mL
产品应置于-20 ℃保存。
产品质控
(1)性能检测 1:
在 50 μL PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质
粒,扩增 15 kb 的 DNA ,在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 15 kb 处检测到非常亮且单一 的目的条带。
(2)性能检测 2:
在 50 μL PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase、大肠杆菌菌落,扩增 5 kb 的 DNA 目的
片段,在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 5 kb 处检测到较亮的单一目的条带。
(3)大肠杆菌核酸残留检测:
在 20 μL 荧光定量 PCR 反应体系加入 1 U P6 High-Fidelity DNA Polymerase 和大肠杆菌特异基因扩增引物
(如 gapA);在不加入大肠杆菌 DNA 模板的情况下,20 个循环内荧光信号值在基线范围。
常规 PCR 反应体系:
P6 High-Fidelity polymerase高保真酶
#21804
2. PCR 反应参数(供参考):
(起始变性): 95 ℃ 5 min
(解链): 95 ℃ 30 sec
(退火): 55 ℃ 30 sec
(延伸): 72 ℃ x min (30-35 循环:2 kb/min)
(终延伸): 72 ℃ 7 min
1. 在冰浴上设置 PCR 反应(供参考):
模板: < 500 ng
2× P6 Buffer: 25 μL
Primer 1/2: 0.2 - 1.0 μM
dNTPs (10 mM): 1 μL
P6: 1 μL
灭菌蒸馏水 Up to 50 μL应用实例
P6 扩增速度测试
以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA ,PCR反应程序设置为:95℃ 5min;98℃ 5sec, 55℃ 30sec,
72℃ 1sec;72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下:
常规 PCR 扩增指南:
1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。
2. 大多数模板的预变性温度为 95 度,30 sec-5 min。
高 GC 含量模板预变性温度为 98 度,30 sec-5 min。
3. 常规退火时间设置为 10 sec,复杂模板设置为 10 sec-30 sec。
P6 扩增不同长度的 DNA
以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA ,PCR 反应程序设置为:
95 ℃ 5min;98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min;72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下:
长片段扩增指南:
1. 使用高质量的模板。
2. 增加引物长度提高退火温度,退火/延伸合并成一步。
3. 添加适当浓度的 DMSO,一般不高于 5%。
4. 增加体系中 P6 使用量。
5. 提高变性温度为 98 度,缩短变性时间为 5 sec。
P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA
以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA ,程序设置为:95 ℃ 5min;95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec,
72 ℃ 1 sec;72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下:
高 GC 和低 GC 模板扩增指南
1. 使用高质量的模板。
2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO,一般终浓度不高于 5%。
3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度,还可使用 Touch
down 的方法进行 PCR 扩增。
4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。