ToloScript Reverse Transcriptase反转录酶

ToloScript Reverse Transcriptase反转录酶

是将 PCR 反应用到的超保真 P6 DNA 聚合酶、buffer、dNTP Mixture 以及稳定剂以 2倍的终浓度进行混合。使用时，只需在制品溶液中加入模板和引物便可进行 PCR反应，大大简化了操作过程，降低了 PCR操作过程中污染的可能性。P6 High-Fidelity DNA Polymerase 是基于 Pyrococcus furiosus 的高温 DNA聚合酶，具有耐热型 5´-3´ 的聚合酶活力以及 3´-5´的核酸外切酶活力，因此属于高保真 DNA 聚合酶（其保真度达到普通 Taq 酶的 55 倍）。该酶经过生物工程改造后，其扩增能力、保真度都得到提升，并且具有广泛的模板适应性，扩增速度达到 2-4 kb/min。优化的 Premix 针对 λ DNA 等简单模板的有效扩增长度可达 40 kb，cDNA 有效扩增长度可达 15 kb，基因组有效扩增长度可达 20 kb。

ToloScript Reverse Transcriptase反转录酶

无染料 

2×P6 High-Fidelity Premix 

Loading buffer 

预混液应置于-20 ℃保存，避免反复冻融。

（1）性能检测 1：

在 50 μL PCR 反应体系加入 25 μL premix、100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒，扩增 15 kb 的 DNA目的片段，在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 15 kb 处检测到非常亮且单一的目的条带。

（2）性能检测 2：

在 50 μL PCR 反应体系加入 25 μL premix、大肠杆菌菌落，扩增 5 kb 的 DNA 目的片段，在 30 个循环扩增后经 1%琼脂糖凝胶检测可在 5 kb 处检测到较亮的单一目的条带。

（3）大肠杆菌核酸残留检测：

在 20 μL 荧光定量 PCR 反应体系加入 10 μL premix（无染料）和大肠杆菌特异基因扩增引物（如 gapA）；

在不加入大肠杆菌 DNA 模板的情况下，20 个循环内荧光信号值在基线范围。

ToloScript Reverse Transcriptase反转录酶

* 针对不同类型的模板，所需的模板量会有不同，如基因组和质粒，等等；需要根据实际情况，添加合适的模板量。

** 退火温度需根据引

物和模板实际的 G+C 含量来作调整。 mix

2. PCR 反应参数（供参考）**：

(起始变性): 95 ℃ 5 min

(解链): 95 ℃ 30 sec

(退火): 55 ℃ 30 sec

(延伸): 72 ℃ x min （30-35 循环：2 kb/min）

(终延伸): 72 ℃ 7 min

(临时保存): 16 ℃ 保温

1. 在冰浴上设置 PCR 反应（供参考）*：

模板: < 500 ng

2× P6 High-Fidelity Premix: 25 μL

Primer 1/2: 0.2 - 1.0 μM (final conc.)

灭菌蒸馏水 Up to 50 μL

2× P6 High-Fidelity Premix 高保真酶​应用实例

P6 扩增速度测试

以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA的片段，PCR反应程序设置为：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下：

常规 PCR 扩增指南：

1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。

2. 大多数模板的预变性温度为 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板预变性温度为 98 度，30 sec-5 min。

3. 常规退火时间设置为 10 sec，复杂模板设置为 10 sec-30 sec。

P6 扩增不同长度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA的片段，PCR 反应程序设置为： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下：

长片段扩增指南：

1. 使用高质量的模板。

2. 增加引物长度提高退火温度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加适当浓度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高变性温度为 98 度，缩短变性时间为 5 sec。

P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序设置为：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下：

高 GC 和低 GC 模板扩增指南

1. 使用高质量的模板。

2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO，一般终浓度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度，还可使用 Touch down 的方法进行 PCR 扩增。

4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。 

以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA的片段，PCR反应程序设置为：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下：

常规 PCR 扩增指南：

1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。

2. 大多数模板的预变性温度为 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板预变性温度为 98 度，30 sec-5 min。

3. 常规退火时间设置为 10 sec，复杂模板设置为 10 sec-30 sec。

P6 扩增不同长度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA的片段，PCR 反应程序设置为： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下：

长片段扩增指南：

1. 使用高质量的模板。

2. 增加引物长度提高退火温度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加适当浓度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高变性温度为 98 度，缩短变性时间为 5 sec。

P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序设置为：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下：

高 GC 和低 GC 模板扩增指南

1. 使用高质量的模板。

2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO，一般终浓度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度，还可使用 Touch down 的方法进行 PCR 扩增。

4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。 

以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA的片段，PCR反应程序设置为：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下：

常规 PCR 扩增指南：

1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。

2. 大多数模板的预变性温度为 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板预变性温度为 98 度，30 sec-5 min。

3. 常规退火时间设置为 10 sec，复杂模板设置为 10 sec-30 sec。

P6 扩增不同长度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA的片段，PCR 反应程序设置为： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下：

长片段扩增指南：

1. 使用高质量的模板。

2. 增加引物长度提高退火温度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加适当浓度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高变性温度为 98 度，缩短变性时间为 5 sec。

P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序设置为：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下：

高 GC 和低 GC 模板扩增指南

1. 使用高质量的模板。

2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO，一般终浓度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度，还可使用 Touch down 的方法进行 PCR 扩增。

4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。 

以pUC18质粒为模板扩增不同长度的DNA的片段，PCR反应程序设置为：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。结果如下：

常规 PCR 扩增指南：

1. 简单模板如质粒等可按照 5 sec/kb 设置程序。

2. 大多数模板的预变性温度为 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板预变性温度为 98 度，30 sec-5 min。

3. 常规退火时间设置为 10 sec，复杂模板设置为 10 sec-30 sec。

P6 扩增不同长度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 质粒为模板扩增不同长度的 DNA的片段，PCR 反应程序设置为： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。结果如下：

长片段扩增指南：

1. 使用高质量的模板。

2. 增加引物长度提高退火温度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加适当浓度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高变性温度为 98 度，缩短变性时间为 5 sec。

P6 扩增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因组为模板扩增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序设置为：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。结果如下：

高 GC 和低 GC 模板扩增指南

1. 使用高质量的模板。

2. 高 GC 模板可适当添加 DMSO，一般终浓度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可适当提高退火温度，还可使用 Touch down 的方法进行 PCR 扩增。

4. 低 GC 含量模板可以适当降低退火温度。